DNA樣品

[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶緩沖液、醋酸銨、TE、無水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、過硫酸銨、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift結(jié)合緩沖液、溴酚藍

水浴鍋 PCR儀 離心機 電泳儀 電泳槽

一、探針的標記

1.   如下設(shè)置探針標記的反應(yīng)體系：

（1）待標記探針 (1.75 pmol/微升) ：2微升。

（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。

（3）Nuclease-Free Water ：5微升。

（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。

（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。

（6）總體積 10微升

（7）按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。

2.   使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。

3.   加入1微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應(yīng)。

4.   再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標記效率。

5.  標記好的探針*好立即使用，*長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。

二、 探針的純化

通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：

1.  對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。

2.   在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。

3.  在4℃，12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。

4.   在4℃，12 000 g-16 000 g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。

5.   加入100微升TE，完全溶解沉淀。標記好的探針*好立即使用，*長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在 -20℃。

三、EMSA 膠的配制

1.   準備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當?shù)哪＞摺?好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。

2.   按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。

（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。

重蒸水 16.2毫升。

（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。

（3）80% 甘油： 625微升。

（4）10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) ：150微升。

（5）TEMED ：10微升

3.  按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。

四、EMSA結(jié)合反應(yīng)

1.   如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)

陰性對照反應(yīng)：

(1）Nuclease-Free Water ：7微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 0微升。

（4）標記好的探針 ：1微升。

（5）總體積 ：10微升。

樣品反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water ：5微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。

（4）標記好的探針： 1微升。

（5）總體積： 10微升。

探針冷競爭反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 2微升。

（4）未標記的探針： 1微升。

（5）標記好的探針： 1微升。

（6）總體積 ：10微升。

突變探針的冷競爭反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。

（4）未標記的突變探針： 1微升。

（5）標記好的探針： 1微升。

（6）體積 ：10微升

Super-shift反應(yīng)：

（1）Nuclease-Free Water：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。

（4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。

（5）標記好的探針：1微升。

（6）總體積 ：10微升。

2.   按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。

3.   加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至能觀察到藍顏色即可。

五、 電泳分析

1.  用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。

2.   把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色)，用于觀察電泳進行的情況。

3.   按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。

4.   剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。

5.  干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當儀器設(shè)備檢測。

一、常見問答

1.  什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗？

凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)*初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA復(fù)合物或RNA復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。

2.  實驗中需要用到什么試劑？

凝膠遷移實驗需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作末端標記，同位素標記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe/sup系統(tǒng)（a,b）可用于同位素標記的RNA的體外合成，DNA 5'末端標記系統(tǒng)，用于制備DNA探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly（dI:dC）dI:dC），也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。

3.  凝膠遷移實驗系統(tǒng)提供了什么試劑？

Promega公司提供一種凝膠遷移實驗系統(tǒng)檢測DNA結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實驗的一種陽性對照。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸，對照DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標記所需的試劑。Core 系統(tǒng)包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液，和能作20次對照實驗的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)含另外5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID結(jié)合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標記后用作特異性探針，或在競爭實驗中用作非特異性探針。

4.  成功進行凝膠遷移實驗，需要優(yōu)化哪些因素？

凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點特點的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或**）?？傊?，反應(yīng)總體積應(yīng)*?。?0μl）。為滿足一般要求，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl（pH7.5）， 0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES（pH7.9）， 50mM KCl，1mM DTT， 1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作為優(yōu)化實驗的起始。

5.  在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？

目的DNA的長度應(yīng)小于300bp，以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp），這樣結(jié)合位點可和其他因子的結(jié)合位點區(qū)別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。

6.  用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

當用HeLa細胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時，每1個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個單獨的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。