流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：Heochst 33342/PI雙染色法
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方法原理
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經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細(xì)胞一經(jīng)固定就不再是活細(xì)胞，而且細(xì)胞固定過(guò)程對(duì)細(xì)胞膜的通透性也有影響。因此發(fā)展了用“細(xì)胞活性”鑒定染料染色的流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法。這些方法細(xì)胞不經(jīng)固定就直接用DNA染料染色，且染料的濃度要比固定細(xì)胞所用的濃度要低得多。
流式細(xì)胞儀通常根據(jù)細(xì)胞膜完整性將細(xì)胞分為“活細(xì)胞”和“死細(xì)胞”，因此正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞歸為活細(xì)胞。活細(xì)胞染料如Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有太大得細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度增高的機(jī)制與凋亡細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變有關(guān)，凋亡細(xì)胞早期細(xì)胞膜的完整性沒(méi)有明顯性改變，但細(xì)胞膜的通透性已有增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342比正常細(xì)胞的多。
此外，還與凋亡細(xì)胞的染色體DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合以及凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等有關(guān)。既然Hoechst 33342進(jìn)入凋亡細(xì)胞中比正常細(xì)胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不經(jīng)固定的情況下對(duì)這些染料是拒染，壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。
根據(jù)這些特性，用Hoechst 33342結(jié)合PI或EB等染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+），壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。
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實(shí)驗(yàn)材料
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細(xì)胞
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試劑、試劑盒
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Heochst 33342 染液 PBS 蒸餾水
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儀器、耗材
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400目篩網(wǎng) 流式細(xì)胞儀 冰箱
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實(shí)驗(yàn)步驟
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一、細(xì)胞培養(yǎng)
懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342 ，終濃度為1 ug/ml； 37℃孵育7-10 min。
二、細(xì)胞收集
低溫500 ~ 1 000 r/min離心5min棄去染液。
三、染色
加入1.0 ml PI染液，4℃避光染色15 min。
四、過(guò)濾
400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次。
五、流式細(xì)胞儀分析
Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為352 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)為400 ~ 500 nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。
六、結(jié)果判斷
在蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。
收起
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注意事項(xiàng)
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1. 在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見(jiàn)到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。
2. 用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20 min之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。
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